„Umělé oplodnění” = oplodnění ve zkumavce (in vitro fertilizace – IVF)

Párům, které nemohou docílit otěhotnění přirozenou cestou, lze prostřednictvím „umělého oplodnění dopomoci k vytouženému potomkovi. Existuje velmi mnoho rozdílných variant in vitro fertilizace (IVF).

1. Inseminace
2. In vitro fertilizace - IVF
3. Výběr blastocyst
4. ICSI
5. IMSI
6. Speciální techniky
7. Kryokonzervace – zmražení


Podstatou reprodukční medicíny je dosažení MAXIMA šancí na úspěch v každé individuální situaci!
To se může podařit jen tehdy, když se budeme snažit „dosáhnout“ optima v každé oblasti, počínaje optimální přípravou léčby, výběrem optimálního terapeutického plánu a stimulace, výběrem nejlepších technik punkce vajíček / folikulů, přes vynikající práci laboratoře včetně výběru blastocyst a IMSI, dále nezapomínejme na dobrý transfer embrya a následnou medikaci po transferu embrya / inseminaci až po péči v těhotenství.

 

 

Vztah mezi věkem a šancemi na otěhotněnít

Šance na otěhotnění, resp. „Baby – Take – Home – Rate“ (BTHR – narození zdravého dítěte) zcela pochopitelně klesá s přibývajícím věkem, hlavně u ženy.


 
Pravděpodobnost otěhotnění a porodu zdravého dítěte (Baby – Take – Home – Rate) ve vztahu k věku ženy – vyjádřeno v procentech

U umělého oplodnění k tomu přibudou ještě různé faktory, které dodatečně negativně ovlivní procentní údaje v aktuální věkové skupině:

• Hormonální poruchy, které nejsou optimálně zvládnuty medikamentózní léčbou
• Endometrióza
• Vývojová anomálie dělohy
• Nezhoubné nádory dělohy (myomy)
• Mnoho dalších faktorů ...

Metodu IUI lze nabídnout mladým ženám (do věku 38 let) jako první terapeutickou opci ve 3 – 6 cyklech. Základní podmínkou jsou otevřené vejcovody u ženy a normální spermiogram u muže. (kriteria WHO)

U párů splňujících tyto podmínky je příčinou infertility většinou syndrom polycysticých ovárií (PCOS) u ženy. V tomto případě podáváme hormony stimulující folikuly (gonadotropin, clomifen), abychom podpořili dozrání 1–2 folikulů ve vaječníku.

Následně je vyvolána ovulace aplikací hCG a sperma je vpraveno do dutiny děložní (cavum uteri).

Spermie putují k vajíčku vejcovodem. K oplodnění vajíčka dochází obvykle v nejvrchnější části vejcovodu.

Oplodněné vajíčko (zygota) začne následně pětidenní cestu do dutiny děložní. Pak ve stádiu blastocysty dospěje do dělohy a začne se zahnizďovat.

Aby děložní sliznice (endometrium) byla na zahnízdění (nidace) optimálně připravena, je nutno podávat patřičné hormony (např. progesteron), zčásti až do doby, kdy bude prokázána pozitivní srdeční akce embrya, 4 týdny po ovulaci nebo po transferu embrya až do 12. týdne gravidity.

     

Link k těhotenskému kalendáři

Od roku 1978 existuje terapeutická možnost dopomoci bezdětnému páru k vlastnímu dítěti metodou in vitro fertilizace v případě uzávěru vejcovodů, různých hormonálních poruch, nekvalitního nebo chybějícího spermatu.

Metodou „in vitro fertilizace“ nebo „extrakorporální oplodnění“ se v zásadě rozumí spojení vajíčka a spermie mimo matčino tělo.

Za tím účelem se odebere vajíčko z vaječníku a následně se přenese do zkumavky (= in vitro) a spojí se spermatem muže.

        

Oplodnění vajíčka spermatem metodou ICSI

Embryo, které takto vznikne, se po pěti dnech vpraví do dělohy (Transfer embrya).

Takový postup je pro rodičovský pár náročnou výzvou. Proto by měl být přístup co nejosobnější a terapie by měla být prováděna v důvěrné atmosféře.

Pár musí být podrobně informován o všech aspektech terapie. Po prostudování stávajících nálezů a po důkladné gynekologické prohlídce a také kontrole spermatu, resp. předchozích přinesených nálezů se sestaví terapeutický plán. V mnoha případech se ukázalo, že příznivě působí, když in vitro fertilizaci předchází psychologická porada.

Přesný popis jednotlivých vyšetření (kontroly na ultrazvuku, hormonální vyšetření, odběry krve atd.) a detaily k medikaci obdrží každý pár ve formě instruktážního prospektu a terapeutického plánu po předchozí konzultaci.

Léčba probíhá individuálně a přizpůsobuje se aktuální situaci.

3.1. Proč po umělém oplodnění následuje výběr blastocyst
3.2. Programovaný neúspěch v Německu a ve Švýcarsku
3.3. Pokročilé umění umělého oplodnění

Po odběru vajíčka (punkce folikulů) s následným oplodněním vajíčka spermií prostřednictvím metod IVF, ICSI, IMSI se embrya musí umístit do živného média.

V inkubátoru jsou ponechána sama sobě. Po 16 až 18 hodinách se provádí první kontrola pod mikroskopem, aby se zjistilo, kolik vajíček bylo oplodněno (většinou více než 70% získaných vajíček).


        
Inkubační skříň a kultivační misky pro embrya


Do roku 1996 se transfer embryí do dělohy prováděl obvykle 2 až 3 dny po punkci folikulů ve stádiu 4 až 8 buněk. Rozvoj nových medií a technik umožnil kultivovat embrya déle, aby mohla být transferována 5. den (zřídkakdy 6. den) po punkci folikulů.

V dnešní době se transfer embryí v našich IVF centrech provádí téměř výlučně ve stádiu blastocysty.

 

3.1. Proč je výběr blastocyst po umělém oplodnění vhodný?

3.2. Naprogramovaný neúspěch v Německu a Švýcarsku

3.3. Pokročilé umění umělého oplodnění

Je-li neplodnost způsobena onemocněním muže, lze při mimotělním oplodnění očekávat velmi dobré výsledky.

Takzvaná intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI metoda) se etablovala v roce 1992 jako milník terapie sterility (zpráva).

Pomocí této metody se jediná spermie injektuje do vajíčka za účelem oplodnění.

Video: Oplodnění vajíčka spermatem pomocí ICSI techniky

Míry oplodnění přes 70% lze ICSI metodou dosáhnout i u pacientů s extremně nízkou koncentrací spermií.

Touto metodou lze pomoci i pacientům, u nichž se primárně nevyskytují v ejakulátu žádné pohyblivé spermie. Pokud v důsledku onemocnění chámovodů nejsou v ejakulátu prokazatelné žádné spermie, lze odebrat sperma z nadvarlat a použít pro ICSI metodu (PESA / MESA). Kdyby se v nadvarlatech nenacházelo sperma, existuje možnost získat spermie přímo z varlat. (TESE / TESA).

Metodou ICSI může být docíleno počtu těhotenství v podobně vysoké míře jako při postupu klasickou metodou in vitro fertilizace.

Přesto pokládáme klasickou ICSI metodu za „zastaralou“.
V našich centrech je nahrazována metodou IMSI.

U klasické IVF (in vitro fertilizace) funguje ochranný obal vajíčka, (zona pellucida – ZP) jako selektivní biologická bariéra proti abnormálním spermiím, takže ve většině případů jsou schopné oplodnit vajíčko jen „normální“ spermie.

U výše popsané ICSI metody se tento mechanismus „přirozeného“ výběru obchází a o výběru spermií rozhoduje morfologické posouzení biologa (zpravidla při zvětšení 200-400x) (Literatura)

Kvalitu subjektivního morfologického nálezu a výběru lze navíc zvýšit novými mikroskopickými technikami „Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection“ (Intracytoplasmatická injekce spermie selektovaná morfologicky) (IMSI).


Zobrazení spermií elektronovým mikroskopem. Obr. 2 a obr. 3 ukazují strukturu – defekty v hlavičce spermie.
Toto zobrazení umožňuje metoda IMSI.

Studie našeho týmu ukázaly, že pravděpodobnost izolovat k oplodnění vajíčka jednu normální spermii bez vakuol, resp. jen s jednou malou vakuolou (= defekty v hlavičce spermie) (≤ 4 % plochy hlavičky), je při použití techniky IMSI výrazně zvýšena v porovnání s metodou ICSI.

Spermie s velkými vakuolami (> 4% plochy hlavičky) působí negativně na vývojový potenciál embryí. Teprve od 3. dne embryonálního vývoje se zapojí geny spermatu (late paternal effect).Viz realizace 3.1

6.1. In vitro Maturace
6.2. Analýza vřetena
6.3. Preimplantační diagnostika
6.4. Diagnostika pólových tělísek
6.5. Diagnostika blastomer ve 3. dnu embryí
6.6. Diagnostika trofektodermu na blastocystách
6.7. Asistovaný hatching
6.8. PICSI
6.9. Polscope

6.1. In vitro Maturace

In vitro Maturace (IVM) je technika, která v individuálních případech a při kontraindikacích klasické stimulace pro metody IVF / ICSI / IMSI nabídne terapii. Touto technikou se získávají vajíčka z nezralých folikulů a kultivací se nechávají dozrát.

Dosažené úspěchy jsou ještě relativně malé a vědecké výzkumy nejsou ještě uzavřeny. V nejvyšším současném internacionálním standardu a po adekvátní poradě poskytujeme tuto techniku těmto pacientkám a pacientům:

• Pacientkám s vysokým rizikem hyperstimulace při polycystických ovariích. Nové techniky stimulace folikulů a cílená terapeutická opatření po punkci folikulů však mohou riziko minimalizovat natolik, že metody IVM je málokdy zapotřebí.

• Pacientkám před chemoterapií, u nichž stimulace folikulů již není možná a vedla by k dalším komplikacím.

Nevýhody metody IVM:

• Ve zkumavce dozrává celkově jen málo vajíček a po oplodnění takových vajíček to může mít škodlivé důsledky na vývoj embrya a plodu.

• Z vyšetření lidských embryí vyšlo najevo, že po otěhotnění metodou IVM vykazuje téměř 80% všech embryí chromozomální poruchy
  
  
  

6.2. Analýza vřetena

Vřeteno hraje ústřední roli v procesu meiotického zrání lidského vajíčka. Zodpovídá za precizní uspořádání a za dělení chromozomů během buněčného dělení.

V 15-20% všech případů není u zralého vajíčka před oplodněním spermií žádné vřeteno. Vedle 1. pólového tělíska je přítomnost vřetena přesným indikátorem zralosti vajíčka.

Čím je žena starší, tím častěji se objevují takové poruchy vřetena. Nepřítomnost vřetena lze dát do souvislosti s výrazným snížením míry oplodnění nebo s nevyvíjejícím se embryem.

 

Na další vývoj embryí má vliv i nasměrování vřetena během zákroku ICSI / IMSI. Za normálních okolností je vajíčko orientováno tak, že 1. pólové tělísko se nachází v pozici u 12h a injekce spermie do vajíčka směřuje na 3h. Není-li vřeteno v optimální pozici (většinou se nachází poblíž 1. pólového tělíska, tedy v odstupu od směru injekce), pak může být nedopatřením zasaženo injekcí se skleněnou kapilárou, což vede ke zničení vajíčka.

I při opakovaném selhání pokusů o oplodnění připadá analýze vřetena velký význam (záhodno individuálně prodiskutovat s lékařem).

Obr.: Zobrazení vřetena s chromozomy ve zralém vajíčku a v pólovém tělísku.

6.3. Preimplantační diagnostika

Preimplantační diagnostika (PID), v angloamerickém prostoru označovaná Preimplantation – Genetic – Diagnosis (PGD), byla původně vyvinuta jako alternativa k prenatální diagnóze. Prenatální diagnózu je možno uplatnit, až když je gravidita etablována, zatímco PID lze provádět na embryu již před započetím těhotenství.

Prostřednictvím PID lze vyšetřením jediné buňky zkoumat přítomnost aneuploidie (chybné dělení chromozomů) a genetických chorob (Přehled, Genetické choroby v detailu, příkladně retinoblastom). To je možno provést buď technikou polymerázové řetězové reakce – Polymerase Chain Reaction (PCR) nebo fluorescenční in situ hybridizace – Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH).

Preimplantační diagnostiky lze použít i k provedení takzvané HLA typizace embrya. HLA typizace slouží k tomu, aby buňkami pupečníkové krve novorozence zachránila sourozence trpícího těžkou chorobou (např. Fanconiho anémie, leukemie, autoimunitní choroby...).

Jestliže dítě se zhoubnou chorobou má v důsledku chemoterapie nebo ozařování zničenou kostní dřeň, pak má šance na přežití, jen když bude mít k dispozici např. od sourozence nebo od vhodného dárce kostní dřeně nebo od dárce pupečníkové krve vhodné kmenové buňky k obnově krevního systému

6.4. Diagnostika pólových tělísek

Diagnostika pólových tělísek (PKD) zkoumá dědičnou výbavu mateřského vajíčka. Takto může být s velkou pravděpodobností potvrzeno nebo vyloučeno chybné dělení chromozomů ve vajíčku a vlohy k určitým dědičným chorobám.

Touto technikou lze především snížit míru potratů, zejména při vyšším věku ženy, resp. případně lehce zvýšit procento otěhotnění. Bližší detaily o této technice a jejím průběhu obdržíte při osobní konzultaci.

6.5. Diagnostika blastomer ve 3. dnu embryí

Biopsie s odběrem 1 až max. 2 buněk (Blastomer) probíhá obvykle 3. den po oplodnění v 6–8 buněčném stadiu.

Tato diagnostika se používá především v případě výskytu dědičných chorob v rodině. Cíleně se dá vyšetřit, zda embryo je rovněž nositelem dědičné choroby. Za účelem transferu mohou být použita jen ta embrya, která nevykazují žádný genový defekt.

V určitých případech se tato diagnostika hodí také k vyšetření poruchy chromozomů (aneuploidie) (např. reciproční translokace).

Pro Aneuploidy-Screening je PKD dodnes „zlatý standard“. To jsme mohli předvést spolu s jedním z průkopníků PID, Yury Verlinskym

Odkaz na literaturu 1
Odkaz na literaturu 2

Nabízíme PID/PGD blastomer v našich IVF centra v Plzni v České republice.

6.6. Diagnostika trofektodermu na blastocyst&aac;ch

Analýza buněk blastocysty v 5. dnu (biopsie trofektodermu) je technika, kterou společně s Alanem Handysidem (průkopníkem PGD) vyvíjíme. Tato technika se u nás ještě nenabízí.

Doufáme, že touto technikou budeme moci v budoucnu podchytit jak poruchy chromozomů (aneuploidy), tak genetické choroby (Přehled, Genetické choroby v detailu) jedinou diagnostikou (dnes je nutno provést kombinovanou diagnostiku PKD a k tomu biopsii blastomer ve 3. dnu embrya).

Pro diagnostiku blastocyst jsou optimální metody kryokonzervace, protože analýza trvá většinou delší dobu, než jakou může být embryo uchováno kultivací. Průkopník a světový expert v oboru kryokonzervace Dr. Pierre Vanderzwalmen je v našem týmu.

Odkazy na literaturu

6.7. Asistovaný hatching

Tato metoda se pokouší usnadnit vzrostlému embryu vyklubání z obalu vajíčka (Hatching). Obal vajíčka (zona pellucida) se naruší laserovým paprskem, mechanicky nebo chemicky.

Její použití je vhodné hlavně tam, kde obal vajíčka je příliš silný nebo příliš rigidní (rozpoznatelné je to pomocí takzvané polarizační mikroskopie a normálním optickým mikroskopem). Především s přibývajícím věkem ženy jsou obaly vajíček silnější a rigidnější, rovněž tak po zmražení a při rozmražení.


    
Klubající se embryo v 5. dnu                          Klubající se embryo v 6. dnu

Tato technika se v souladu s nálezem používá v našich IVF laboratořích velmi individuálně.

6.8. PICSI

PICSI je metoda používaná k výběru zralých spermií v rámci ICSI

(ICSI, IMSI).

Hlavičky zralých spermií mají specifický receptor pro kyselinu hyaluronovou (hyaluronan).

Hyaluronan je důležitou složkou obalu obklopujícího vajíčko. Nezralé spermie tento receptor nemají. Při takzvaném vazebném testu s hyaluronanem (PICSI) se hyluronanu používá k separaci nezralých a zralých spermií. Tyto vázané spermie mohou být použity pro ICSI / IMSI.

    
Vymyté spermie v misce                                             Sběr vázaných spermií

Této technologie se používá jen ve zcela konkrétních případech. PICSI nemůže nahradit IMSI techniku, jen ji může v určitých případech doplnit.

6.9. Polarizační mikroskopie

Obal vajíčka (zona pellucida, ZP) se skládá ze 3 vrstev glykoproteinů a obklopuje vajíčko nebo embryo tak dlouho, dokud toto nevyklouzne. To se děje 5. – 6. den embryogeneze ve stadiu blastocysty.

Prostřednictvím polarizační mikroskopie lze posoudit tloušťku všech tří vrstev ZP. Získané údaje dovolují lepší posouzení kvality ZP u vajíček nebo embryí.

Zdá se, že důležitým neinvazivním ukazatelem vývojového potenciálu vajíčka je především vnitřní vrstva ZP. U pacientek starších 35 let bývá vnitřní vrstva ZP silnější a glykoproteiny jsou, jak se zdá, méně uspořádané.

 
Zamražení a skladování biologického materiálu probíhá při nízkých teplotách. Dosahuje se jich pomocí tekutého dusíku (-196°C). V těchto podmínkách mohou být buňky skladovány dlouhou dobu, aniž by byla ohrožena jejich životnost.

Specifickou metodou kryokonzervace zaměřené na zmražení buněk lze v našich IVF centrech zmrazit následující buňky, resp. tkáně.

    

7.1. Zmražení spermií a tkání varlat
7.2. Zmražení neoplodněných vajíček
7.3. Zmražení oplodněných vajíček
7.4. Zmražení embryí
7.5. Zmražení ovariální tkáně / tkáně vaječníku

7.1. Zmražení spermií a tkání varlat

Spermie lze získat z ejakulátu, z nadvarlat a z tkáně varlat. Všechny tyto spermie mohou být zmraženy a takto konzervovány pro použití k léčbě.

U pacientů s tumorem je pro případ možného poškození tkáně varlat při terapii záhodno nechat si před chemoterapií nebo radioterapeutickou léčbou založit spermabanku, aby z ní později bylo možno použít spermie v případě, že si budou přát dítě.

Výzkumy ukázaly, že doba skladování až 30 let (teoreticky samozřejmě mnohem déle – k tomu ovšem logicky chybí patřičné zkušenosti) nemá žádný vliv na kvalitu spermatu.

Spermie cizích dárců mohou být rovněž zamraženy. Za šest měsíců po kryokonzervaci je dárce v souladu se zákonnými předpisy opět vyšetřen na specifické infekční parametry. Teprve když je tento nález negativní, může být sperma darováno.

Bližší informace k zmražení spermatu

7.2. Zmražení neoplodněných vajíček

Kvůli společenské situaci se první těhotenství plánuje stále později, to je po ukončení vzdělání, po stabilizaci finanční situace atd. K tomu často dochází až po 35. roce života ženy.

Z tohoto důvodu a také vzhledem k biologické skutečnosti, že vajíčka stárnou a že např. po 38. roce dochází k otěhotnění stále obtížněji, se doporučuje nechat si v mladším věku (mezi 20. a 35. rokem) preventivně zmrazit vajíčka.



    Metafáze II -vajíčko

Tím si zajistíte i s přibývajícím věkem, např. mezi 40. – 45. rokem, optimální vyhlídky na otěhotnění.

Tuto techniku zmražení vajíček nabízíme na nejvyšší technické úrovni.

Bližší informace k zmražení vajíček / preventivní zajištění vajíček

7.3. Zmražení oplodněných vajíček

Vajíčka ve stadiu (zygoty)
V 1. dnu vývoje se dají
z technického hlediska dobře zmrazit.

Rozmražení a další vývoj až do stadia blastocysty
má vysokou míru úspěšnosti (95%).

7.4. Zmražení embryí

Embrya mohou být zmražena v jakémkoli vývojovém stadiu (od 2. do 6. dne). Jak metoda pomalého zmražování, tak metoda vitrifikace (rychlé zmražení v tekutém dusíku) jsou v našich IVF centrech úspěšně aplikovány (rozmražení a další vývoj má míru úspěšnosti dobrých 90%). Tímto způsobem lze konzervovat přebytečná embrya a uschovat je na pozdější dobu.

Pomalé zmražování / pomalé rozmražování (tvorba ledu je kontrolována přes seeding).

Vitrifikace/ zesklovatění (Tekutiny se přemění do pevného
skupenství přímo a bez vytváření ledových krystalů.

7.5. Zmražení ovariální tkáně / tkáně vaječníku

Existuje-li obava z poškození vaječníku (ovaria) v důsledku nemoci, které by ztížilo nebo znemožnilo etablování těhotenství, pak se kromě vajíček může zmrazit také ovariální tkáň.

Také ženy, které si ještě nenašly partnera nebo z profesních důvodů si chtějí přání mít dítě splnit až později, mohou si ve věku mezi 20. a 30. rokem nechat zmrazit svá vajíčka nebo ovariální tkáň pro pozdější terapii.